Szerző: Deák Gábor dr., Bordás Noémi, Szalay István dr.1
1Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Urológiai Klinika
Összefoglalás
Korábban standardizált, új vizsgálati módszert alkalmaztunk a herék és a heréket ért károsító hatások (torzió) in vivo mikrokeringési vizsgálatára: az ortogonális polarizációs spektrális (OPS) képalkotást. A széles körben alkalmazott intravitális fluoreszcens videomikroszkópia (IVM) hátránya, hogy nagy mérető eszközt igényel, és a vizsgálatokhoz fluoreszcens anyag keringésbe juttatására van szükség. Az OPS képalkotással szintén in vivo megjeleníthető és vizsgálható a mikrokeringés, azonban ehhez nem kell semmit az érpályába fecskendezni, és a berendezés mobilis vizsgálófeje is elfér egy tenyérben.
A módszer további előnye, hogy – ellentétben például a lézer Doppler fluximetriával – alkalmas a mikrokeringés heterogenitásásváltozásának térbeli (funkcionális kapilláris denzitás: FCD) megfigyelésére és mérésére is, az áramlási sebesség meghatározásán felül. Ezt az új eszközt használtuk a herék FCD-vizsgálatára állatkísérletekben, és tanulmányoztuk a heretorzió és reperfúzió FCD-re kifejtett káros hatását.
Megállapítottuk, hogy a herék FCD-je kontroll állapotban 16,34±1,57 1/cm, és a torziót követő reperfúzió során a kiindulási érték 50%-a körüli értékre zuhan, és marad is a vizsgált 240 perces időszakban.
A módszer kiválóan alkalmas ilyen jellegû vizsgálatokra, és ezáltal akár humán felhasználása is lehetséges. A FCD-romlás fontos szerepet játszhat a torzió/reperfúzió okozta károsodásokban.
Bevezetés
A herék egyik leggyakoribb sürgősségi beavatkozást igénylő károsodása a heretorzió. Ennek során a here a funiculus mentén különböző fokban megcsavarodik, ami gátolja a saját vérellátását (1, 2). A műtétileg megmentett herékben szöveti gyulladásos jelenségek, késői atrophia, illetve a spermiogenezis zavarai alakulhatnak ki(3). A herében létrejövő funkcionális vagy szöveti károsodások a vizsgálatok alapján (4, 5) nagymértékben függnek a torzió fokától és időtartamától. A herekárosodás pontos mechanizmusa vizsgálatok tárgya jelenleg is, de biztosra vehető, hogy a kialakult sejtszintű hipoxia és a reperfúzió során létrejövő mikrocirkulációs gyulladásos folyamatok (leukocyta–endothelsejt interakciók), valamint az ezeket követően felszabaduló oxigén szabadgyökök és proteolitikus enzimek fontos szerepet játszanak (6).
A mikrocirkuláció lehetővé teszi a tápanyag sejtekhez jutását, valamint a szöveti oxigenizációt. A 300 µm-nél kisebb átmérőjő arteriolák és venulák közötti véráramlásként definiálhatjuk. Fő feladata a megfelelő parciális nyomású és mennyiségő oxigén eljuttatása a mitokondriumba.
A mikrocirkuláció heterogenitásáról két fő paraméter, a vörösvértestek áramlási sebessége (RBCV) és a funkcionális kapilláris denzitás (FCD) ad felvilágosítást. Míg az első paraméterből csak az időbeli heterogenitásról kapunk felvilágosítást (7), addig az FCD a mikrokeringés térbeli heterogenitását is prezentálja, információt szolgáltat a funkcionáló és az át nem járt kapillárisokról, illetve ezek arányáról is. Heretorzió/reperfúzió során a feltételezett FCD-romlás fontos mérőszáma lehet a mikrocirkulációs károsodásoknak, melynek vizsgálatára korábban nem volt lehetőség. Ez az adat a klinikum számára is fontos mérőszám lehet a noxa erősségének vagy a prognózisa meghatározásában, illetve segíthet a helyes kezelési stratégiák megtervezésében.
A különböző szervek ischaemiás károsodása legelőször a mikrocirkuláció szintjén okoz változásokat, azaz a mikrokeringési változások az első indikátorai az egyes szervek ischaemiás szöveti vagy funkcionális károsodásainak. A kialakuló mikrocirkulációs változások függenek a noxa erősségétől, hosszától, a keringés megelőző állapotától és különböző szervspecifikus tulajdonságoktól is.
A mikrokeringés vizsgálatának két elterjedt módszere az intravitális fluorescens videomikroszkópia (IVM) és a lézer Doppler fluximetria (LDF). Az IVM alkalmasnak bizonyult számos szerv esetében, szinte minden lényeges mikrocirkulációs paraméter vizsgálatára. Azonban az eszköz relatíve nagy mérete, helyhez kötött volta, valamint a vizsgálatokhoz szükséges fluoreszcens anyag miatt csak állatkísérleti felhasználása lehetséges (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17). A LDF már mobilabb, nem igényel kontrasztanyagot sem, azonban ezzel a módszerrel a mikrokeringésnek csupán az áramlásos paramétereiről kapunk információt, térbeli megjelenítésre vagy pl. a véralkotóelemek közti interakciók megfigyelésére nincs mód (18).
Az ortogonális polarizációs spektrális (OPS) képalkotás viszonylag új mikrocirkulációs vizsgálati módszer, mellyel noninvazív módon, in vivo vizsgálhatók egyes szervek. A műszer kézi fejegysége mobilis, rendkívül könnyen alkalmazható bármilyen diagnosztikai vagy műtéti szituációban, és a vizsgálat nem igényel semmilyen kontrasztanyagot, ezért human alkalmazása is lehetséges. Segítségével vizualizálható a mikrokeringés, és komponenseinek mind időbeli (RBCV), mind térbeli (FCD) változásai vizsgálhatók.
A szegedi urológiai munkacsoport alkalmazta először az OPS képalkotási technikát a herék in vivo vizsgálatára, és standardizálta a módszert, összehasonlítva az arany standard IVM-technikával (19). Jelen tanulmányunkban állatmodellen ezzel a módszerrel vizsgáltuk a herék FCD-jét, mint a mikrocirkuláció heterogenitásának térbeli mutatóját, és ennek változásait a torziót követően.
Állatmodell
A kísérletek a magyar állatvédelmi törvényekkel és a Szegedi Tudományegyetem állatkísérlet-etikai elvárásaival összhangban folytak. A kísérleti csoportba 6 állat került. Wistar patkányokat használunk, melyek szabadon kapnak tartásuk alatt tápot és vizet. Subcutan atropin (0.1 mg/ testtömeg kg) premedikációt követően pentobarbital (45 mg/testtömeg kg) intraperitoneális narkózist alkalmazunk. Az állatokat fűthető mőtőasztalra helyezzük, majd az a. carotist és v. jugularist kanüláljuk. Tracheostomiát követően intubációt végzünk. Regisztráljuk a maghőmérsékletet, az artériás vérnyomást és a pulzusszámot. A bal scrotumon ejtett metszésből a herét előemeljük, és speciális tartóra helyezzük az OPS-vizsgálatok elvégzéséhez. Az ischaemiát a funiculus – óramutató járásával megegyező – 720 fokos tekerésével érjük el. Az ischemia alatt a heréket a scrotumba visszahelyezzük 60 percre. Ezt követően a heréket ismét előemeljük, megszüntetjük a torziót és OPS-vizsgálatokat végzünk. A herék mikrokeringését a torzió előtt (kontroll), majd a reperfúzió 60, 120, 180 és 240. percében vizsgáljuk (19).
Ortogonális polarizációs spektrális (OPS) képalkotás
Az OPS képalkotás relatíve új módszer (1999), mellyel noninvazív módon, a vizsgálófej közvetlenül szervfelszínre helyezésével vizsgálhatjuk a különböző szövetek mikrocirkulációját (19, 20, 21). A készülék (CYTOSCAN A/R, Cytometrics, PA, USA) hordozhatósága, kis mérete, illetve az, hogy a vizsgálat nem igényli fluoreszcens, toxikus anyag bejuttatását, lehetővé teszi az állatokon végzett vizsgálatokon túl a humán kísérleti vagy diagnosztikai alkalmazását is (22).
Ez a módszer a szövetben szóródott polarizált fényt teszi láthatóvá az oxi- és deoxihemoglobin izobesztikus pontjánál (548 nm), ennek megfelelően hemoglobin tartalmú struktúrák (erek) vizsgálatára alkalmas. Az OPS-technika előnye tehát, hogy alkalmazásakor fluoreszcens markerre nincs szükség, így a mikroszkópia fototoxikus hatása is kiküszöbölhető.
A mikrokeringés változásainak regisztrálása S-VHS videófelvételeken történik (Panasonic AG-MD 830), a rögzített felvételeket off-line, számítógépes program segítségével elemezzük.
Funkcionális kapilláris denzitás (FCD)
Azon kapillárisokat tartjuk funkcionálóknak, amelyeken 45 másodperces perióduson belül észlelhető vörösvértest-áramlás. FCD alatt azt a viszonyszámot értjük, amely egyenlő a vizsgált mikroszkopikus látómező adott területén levő funkcionáló kapillárisok teljes hossza és az adott terület hányadosával (1/cm). Egy vizsgált terület általában 5–10 mikroszkopikus látóteret tartalmaz (23).
Statisztikai analízis
Kísérleteink statisztikai analíziséhez a SigmaStat programot használtuk (Jandel Corporation, San Rafael, CA, USA). Az adatokat átlag±átlag standard hibája (SEM) szerint fejeztük ki. A csoporton belüli különbséget az egy szempontos ANOVA teszttel határoztuk meg, majd a Bonferroni-tesztet alkalmaztuk. A szignifikanciaszintet P<0,05 szerint határoztuk meg.
Eredmények
A herékre – normál állapotban – sajátos, fluktuáló kapilláris áramlás jellemző, mely a torziót követő reperfúzió korai szakában megszűnik, azaz az áramlás folyamatos jelleget ölt. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy kóros állapotban a here keringésére jellemző időbeli heterogenitás megszűnik.
A mikrokeringés térbeli heterogenitása az OPS technika révén szintén számszerűen meghatározható, melyet az FCD révén hasonlítottunk össze kontroll állapotban és torziót követően.
A herék FCD-je 16,34±1,57 1/cm-nek bizonyult kontroll állapotban.
A torzió során a FCD nullára zuhant.
A reperfúzió során, a keringés visszatértével, az FCD és az átjárt kapillárisok százalékos aránya is szignifikánsan emelkedett, de a reperfúzió 60, 120, 180 és 240. percében is szignifikánsan alacsonyabb volt (FCD: 7,65±1,2; 9,8±2.47; 9,86±1,71; 8,86±0,71 1/cm; átjárt kapillárisok aránya: 45,33±6,83%, 61,91±24,54%, 58,46±13,00%, 63,04±17,33% egyenként, a vizsgált időpontokban), mint a kontroll értékek. (1. ábra) (2. ábra)
Megbeszélés
Az emberi és a fejlett állati szervezetekben a kapillárisok képviselik azt a legkisebb funkcionális egységet, amelyben a vér és a szövetek közötti interakciók létre tudnak jönni. Ennek a rendszernek a kutatása egyedülálló lehetőséget kínál különböző folyamatok megértéséhez, és egyúttal kapcsolatot teremt a klinikai és a molekuláris medicina között. Annak ellenére, hogy a betegségek többnyire sikeres diagnózisa és kezelése külső információkon alapul, ez nem teljesen elégséges az egész kórfolyamat megértéséhez, melyek többsége a mikrocirkuláció szintjén történik.
Bár a mikroszkópiát, mint technikát, Malpighi anatómiai tanulmányaiban már 1661-ben bevezette, csak a XIX. század végén kezdték alkalmazni betegségek vizsgálatára, míg in vivo mikroszkópos megfigyelésekre csak a XX. század utolsó negyedében nyílt lehetőség (24), Napjainkban pedig olyan fejlett technológiák állnak rendelkezésünkre a mikrocirkuláció (azon belül a FCD) in vivo vizsgálatára, mint az IVM vagy az OPS-képalkotás.
Ezeknek a fejlett vizsgálómódszereknek az alkalmazása, illetve a mikroszkópos szintű statikus vizsgálatok dinamikussá válása, eltolódáshoz vezetett a betegségek diagnosztikájában a makroszkóposról a mikroszkópos szintre, és teljesen új szemléletet hozott az orvostudományba. Mindazonáltal a molekuláris, genetikai és sejtbiológiai új eredmények többnyire nem hoztak áttörő sikereket. Ez vezette arra a kutatókat, hogy kapcsolatot keressenek ezen két szint közt, melyet – úgy tőnik – a mikrokeringésben, a kapillárisok szintjén találtak meg. Ennek mérhető, számszerű jellemzői közül egyik legfontosabb paraméter az FCD.
Az urológiai szervek közül, a húgyhólyaggal kapcsolatban a szegedi-müncheni munkacsoport írta le először a FCD jelentőségét és változásait fiziológiás (25) és különböző patológiás állapotokban. A húgyhólyag ischemiát követő reperfúziója során az FCD jelentős romlását észlelték (26).
Számos aspektusból vizsgálták a húgyhólyag-ischaemia/reperfúzió (I/R) okozta mikrovaszkuláris károsodások befolyásolásának lehetőségeit.
Tanulmányozták az endothelin (ET)-1 fenti változásokra kifejtett hatását ET-A- receptor-antagonista alkalmazásával. A kezelés az I/R által indukált mikrokeringési változásokat (köztük a FCD romlását) kedvezően befolyásolta (27).
A nitrogén-monoxid (NO) húgyhólyag-I/R-t követő mikrokeringési károsodásokra kifejtett hatásának vizsgálatakor a kísérleti állatokat NO-szintézis gátló NG-nitro-L-arginin- metilészter (L-NAME) és NO-prekurzor L-arginin adásával vizsgálták. Míg az L-NAME- előkezelés nem befolyásolta a mikroperfúziót (azaz a FCD-t sem), addig az L-arginin-előkezelés javította az FCD és RBCV értékeit (28).
Az intakt húgyhólyag vizsgálatán túl, a munkacsoport kidolgozott egy módszert a vékonybéllel augmentált hólyag mikrokeringési változásainak vizsgálatára is. Megállapították, hogy a bélkomponens érzékenyebben reagál az intralumináris nyomásemelkedésre, és az FCD már a „leak point pressure”-nél alacsonyabb szinten zavart szenved (29).
A FCD-nek, mint mikrovaszkuláris paraméternek a változását Kerger és mtsai kulcsfontosságúnak találták a szövetek túlélésének vizsgálata során, éber állatok haemorrhagiás shockja kapcsán. Azt állapították meg, hogy az FCD bizonyos szint fölötti értéke volt az egyetlen megfigyelhető funkcionális faktor mikrocirkulációs szinten, mely különbséget mutatott a túlélő és a nem túlélő állatok közt. Ezen kívül megfigyelték, hogy az olyan, klinikailag mérhető változások (például vazokonstrikció), melyek segítenek a szervek makroszkópos perfúziójának fenntartásában, nem feltétlenül eredményezik a kapillárisfunkció fenntartását is (30).
Cabrales és mtsai azt észlelték, hogy az FCD kapcsolatot mutat a centrális vérnyomással, a plazmaviszkozitással és a mikrovaszkulatúra tónusával is (31).
Jelen vizsgálatainkban sikerült in vivo körülmények között, humán vizsgálatokra is alkalmas módszerrel vizsgálnunk a herék egyik legfontosabb mikrocirkulációs paraméterét, az FCD-t, állatmodellen. Bebizonyítottuk, hogy heretorziót követően jelentős FCD-károsodás alakul ki, és a reperfúzió vizsgált 240. percében nem is áll helyre. Ezen mikrocirkulációs változás fontos jelentőséggel bírhat a torziót követő herefunkció-zavarokban.
A klinikumban több olyan, heréket érintő betegség is ismert, melyek kóreredetében, a torziónál észleltekhez hasonlóan feltételezhető a mikrocirkuláció valamilyen szintű zavara. Tekintettel arra, hogy a here mikrokeringése csak a scrotum megnyitása után, azaz műtéti körülmények közt lenne vizsgálható, erre a célra feltételezhetően az OPS képalkotás lesz alkalmas a humán gyakorlatban, és ez a vizsgálómódszer, valamint a herék mikrokeringési változásainak, köztük a FCD változásainak pontosabb megismerése új utakat nyithat meg mind a kutatás, mind a klinikum számára.
2. Workman SJ, Kogan BA: Old and new aspects of testicular torsion. Sem Urol. 1988; 6: 146.
3. Bartsch G, Frank S, Marberger H.: Testicular torsion: late results with special regard to fertility and endocrine function. J Urol. 1980; 124: 829.
4. Bajory Z, Szabó A, Varga R, Pakaski M, Pajor L, Boros M.: The role of endothelin-1. in the pathomechanism of torsion-induced microcirculatory injury and aspermatogenesis in the rat. Br J Urol 2004; 94 (suppl. 2.): MP–17.22.
5. Oettle AG, Harrison RG.: The histological changes produced in the rat testis by temporary and permanent occlusion of the testicular artery. J Pathol Bacteriol 1952; 64: 27.3.
6. Pákáski M, Bajory Z, Varga R, Szabó A, Pajor L, Boros M.: Endothelin-A receptor antagonism reduces torsion-induced aspermatogenesis and microcirculatory failure in the rat. Eur Surg Res 2002; 34(suppl 1): pp41.
7. Bajory Z, Szabó A, Pajor L, Boros M.: Pressure-flow relationship after enterocystoplasty in rats. An intravital microscopy study. Shock 1999; 12: 200.
8. Harris AG, Hecht R, Peer F, Nolte D, Messmer K: An improved intravital microscopy system. Int J Microcirc Clin Exp. 1997; 17(6): 322–327.
9. Bajory Z, Hutter J, Krombach F, Messmer K.: Microcirculatory changes in ischemia-reperfusion-induced cystitis in rats. Eur Surg Res 2002; 34(suppl 1): pp53.
10. von Dobschuetz E, Pahernik S, Hoffmann T, Kiefmann R, Heckel K, Messmer K, Mueller-Hoecker J, Dellian M: Dynamic intravital fluorescence microscopy—a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 2004; 67(1): 55–63.
11. Bajory Z, Szabó A, Pajor L, Boros M, Hutter J, Krombach F, Messmer K: Intravitális mikroszkópia, új módszer a húgyhólyag mikrocirkulációjának vizsgálatára patkányban. Magyar Urológia 2004; 3: 158–164.
12. Messmer K, Krombach F.: Microcirculation research in experimental surgery. Chirurg 1998; 69: 333–338.
13. Bajory Z: A nitrogén-monoxid szerepe állatmodellen végzett hólyagiszkémia-reperfúzióban. Magyar Urológia 2006; 2: 97–101.
14. Zeintl H., Tompkins WR., Messmer K., Intaglietta M.: Static and dynamic microcirculatory video images analysis applied to clinical investigations. Prog Appl Microcirc 1986; 11: 1–10.
15. Bajory Z, Szabó A, Pajor L, Boros M: Intravital microscopic examinations of the microcirculatory consequences of enterocystoplasty in the rat. J Physiol 2000; 526P: pp.150P
16. Zeintl H, Sack FU, Intaglietta M, Messmer M: Computer assisted leukocyte adhesion measurement in intravital microscopy. Int J Microcirc Clin Exp 1989; 8: 293–302.
17. Bajory Z, Varga R, Szabó A, Pákáski M, Pajor L, Boros M.: Reduction of torsion-induced aspermatogenesis and microcirculatory failury by endothelin-A receptor inhibition Acta Physiol Hung 2002; 89(1-3): pp 66.
18. Riva C, Ross B, Benedek GB: Laser Doppler measurements of blood flow in capillary tubes and retinal arteries. Invest Ophthalmol 1972; 11: 936–944.
19. Deák G, Bajory Z, Király I, Szabó A, Varga R, Pajor L, Boros M: A testis mikrokeringés vizsgálata fluoreszcens intravitális mikroszkóppal és ortogonális polarizációs spektrális képalkotással kísérletes heretorzió alatt. Magyar Urológia. 2008; 1: 18–21.
20. Biberthaler P, Langer S, Luchting B, Khandoga A, Messmer K.: In vivo assessment of colon microcirculation: comparison of the new OPS imaging technique with intravital microscopy. Eur J Med Res. 2001; 6: 525–534.
21. von Dobschuetz E, Biberthaler P, Mussack T, Langer S, Messmer K, Hoffmann T.: Noninvasive in vivo assessment of the pancreatic microcirculation: orthogonal polarization spectral imaging. Pancreas. 2003; 26(2): 139–143.
22. Mathura KR, Vollebregt KC, Boer K, De Graaff JC, Ubbink DT, Ince C.: Comparison of OPS imaging and conventional capillary microscopy to study the human microcirculation. J Appl Physiol. 2001; 91(1): 74–78.
23. Bajory Z, Szabo A, Pajor L, Tiszlavicz L, Boros M.: Intravital microscopic assessment of pressure induced microcirculatory changes after enterocystoplasty in rats. J Urol 2001; 165: 1279–1282.
24. Bollinger A, Fagrell B.: Clinical capillaroscopy-a guide to its use in clinical research and practice. Stuttgart: Hogrefe & Huber, 1990.
25. Bajory Z, Hutter J, Krombach F, Messmer K.: New method: the intravital videomicroscopic characteristics of the microcirculation of the urinary bladder in rats. Urol Res. 2002; 30: 148–152.
26. Bajory Z, Hutter J, Krombach F, Messmer K.: Microcirculation of the urinary bladder in a rat model of ischemia-reperfusion-induced cystitis. Urology 2002; 60: 1136–1140.
27. Bajory Z, Hutter J, Krombach F, Messmer K.: The role of endothelin-1 in ischemia-reperfusion-induced acute inflammation of the urinray bladder in rats. J Urol 2002; 168: 1222–1225.
28. Bajory Z, Szabó A, Király I, Pajor L, Messmer K.: The involvement of nitric oxide in microcirculatory reactions after ischemia-reperfusion of the rat urinary bladder. Eur Surg Res 2009; 42: 28–34.
29. Bajory Z, Szabó A, Pajor L, Boros M.: A bélhólyagruptura mikrokeringési okának modellezése állatkísérletben. Magyar Urológia 1999; 4: 385–391.
30. Kerger H, Saltzman DJ, Menger MD, Messmer K, and Intaglietta M.: Systemic and subcutaneous microvascular PO2 dissociation during 4-h hemorrhagic shock in conscious hamsters. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1996; 270: H827–H836.
31. Cabrales P, Tsai AG, Intaglietta M.: Microvascular pressure and functional capillary density in extreme hemodilution with low- and high-viscosity dextran and a low-viscosity Hb-based O2 carrier. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287: H363–H373.